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5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的抗氧化能力研究
发表时间:2012-05-02     来源:JWEDIT

【摘要】 目的:研究5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的抗氧化能力。方法:采用鲁米诺化学发光法测定5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除羟自由基的能力;邻苯三酚自氧化法研究5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除超氧阴离子自由基的能力。结果:5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对?OH有清除作用,且呈现量效关系,其IC50为0.065 mg/mL;5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对O-2.有清除作用,并呈浓度依赖性,当浓度达到0.14 mg/mL 时, 对O-2.的清除率达到50% , 当浓度达到0.39 mg/mL时, 对O-2.的清除率达到80%。结论:5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的水溶性很好,并且有较好的抗氧化能力。

  【关键词】 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺、抗氧化、羟自由基、超氧阴离子自由基

  [ABSTRACT] Objective: To investigate the antioxidant capacity of 5,6 - dimethyl -2,3 - pyrazine amide. Methods: Luminol chemiluminescence and pyrogallol self-oxidation method were applied to detect the scavenging capacity of hydroxy radical and superoxide anion free radical. Results: 5,6 - dimethyl -2,3- pyrazine amide can scavenge?OH in a dose-effect way with IC50 of 0.065 mg/mL; it′s also capable of scavenging superoxide anion free radicals in a concentration -depended way. At a concentration of 0.14 mg/mL, the clearance rate of O2 was 50%, when it increase to 0.39 mg/mL the clearance rate can be as high as 80%. Conclusions: 5,6 - dimethyl -2,3 - pyrazine amide is water-soluble substance with great potential of antioxidant capacity

  [KEY WORDS] 5,6 - dimethyl -2,3 - pyrazine amide; Anti-oxidation, Hydroxyl radical, Superoxide anion free radical

  自由基是生命体活动时所产生的一类活性分子,可被抗氧化剂或自由基清除剂中和。在正常代谢过程中,机体内自由基的生成和消除处于动态平衡状态中。但当人体出现各种负荷状态时,自由基的形成和消除之间的动态平衡就会被破坏,过多的自由基将会导致细胞损伤、病变和非正常死亡,从而诱发多种疾病。大量研究表明,炎症、肿瘤、血液病、动脉硬化、心脏病、老年痴呆、帕金森综合征、肌肉硬化、白内障乃至衰老等病变的产生与体内自由基产生过多或自由基清除能力下降有着密切关系[1]。抗氧化剂或自由基清除剂能有效抑制或缓解自由基对机体的不利影响。因此,用于清除自由基防止脂质过度氧化的抗氧化剂或自由基清除剂的研究已得到普遍关注。

  许多含吡嗪环的化合物具有重要的生理活性,吡嗪类化合物在药物上主要起抗结核,驱饶虫,抗惊厥,抗菌,清除自由基等重要作用。如四甲基吡嗪对两种水溶液体系产生的O2.-和?OH的清除率分别为100%和44%[2]。本文在前期首次合成新化合物5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺[3]的基础上,采用鲁米诺化学发光法测定其清除羟自由基的能力及邻苯三酚自氧化法研究其清除超氧阴离子自由基的能力。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  1.1.1 主要试剂与仪器

  2,3-二氰基-5,6-二甲基吡嗪(Aldrich Co.),Luminol(GR,ACROS试剂),其他试剂均为市售分析纯,所用水为二次蒸馏水。XT5显微熔点测定仪(北京市科伦电光仪器厂);IFFM-E型流动注射化学发光分析仪,IFFS-A型多功能化学发光检测器(西安瑞迈电子科技有限公司);722N型分光光度计(上海精密仪器公司)

  1.1.2 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的合成[3]

  将2,3-二氰基-5,6-二甲基吡嗪(0.474 g,0.03 moL)加到质量分数为5%的氢氧化钠水溶液(48 mL)中,再加入丙酮32 mL,搅拌,于15 min内滴加质量分数为10%的过氧化氢(20 mL),升温至50 ℃,继续搅拌反应,反应现象为溶液颜色从棕褐色经棕黄色、黄色变至透明浅黄,最后随着反应的进行,颜色又逐渐加深直至变为棕褐色,约6 h后,停止反应,于50 ℃以下蒸除丙酮,残余物用甲醇12 mL洗涤,析出沉淀,抽滤,烘干,得黄色粉末状固体0.5 g,收率85% 。m.p.256~259 ℃,与文献[3]报道值一致。

  1.2 方法

  1.2.1 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的羟自由基清除效率的方法

  采用鲁米诺化学发光法测定5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对羟自由基?OH的清除作用。分别用蒸馏水载流、15%的H2O2溶液、0.2 mmol/L Luminol溶液(用pH值为9.95,0.1 mol/L的Na2CO3- Na2HCO3缓冲溶液配制)及5, 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液泵入化学发光分析系统(泵速为30 r/min),记录发光强度的峰值I,测定不同浓度的5, 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液对H2O2溶液-Luminol体系发光的抑制,(光电倍增管工作电压为450,增益1)。以H2O2溶液-Luminol –碳酸盐缓冲溶液为空白对照,测其发光强度I0,5, 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液对羟自由基的清除率(p)的计算公式为: P=I0-II0×100%(Ⅰ)

  1.2.2 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的超氧阴离子自由基清除效率的方法

  用分光光度法测定样品5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对碱性邻苯三酚体系产生超氧阴离子自由基O2.-的清除作用。将5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺用水溶解(其水溶性很好),配成1 mg/0.6 mL的浓度,取XμL(X=0、2、5、10、20、30、40)样品液,加入到(1475-X)μL Tris-HCl缓冲液中(0.05 mmol/L,pH=8.2,含1 mmol/LEDTA),再加25 μL邻苯三酚溶液,迅速混合, 用722 N型分光光度计在325 nm 处测其吸光度,开始计时从60 s开始,此后每隔30 s读数测一次吸光度值(325 nm),到300 s为止。以Tris-HCl缓冲液为空白调零,0 μL样品液为阳性对照组。温度为25 ℃时, 通过调整邻苯三酚溶液浓度来控制其自氧化速率(以325 nm处吸光度的变化计)约等于0. 070 min-1。5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对O2.-的清除效率( S )由下式计算:S=K0-K1K0×100%=[(△A/△t)对照-(△A/△t)](△A/△t)对照×100% (Ⅱ)式中, K0为邻苯三酚自氧化速率, K1为加入5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺后邻苯三酚的自氧化速率。

  2 结果

  2.1 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对羟自由基的清除

  测定浓度分别为0.025、0.05、0.075、0.11、0.15、0.2、0.25的5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液的发光强度I,见表1、图1。表1 5, 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对?OH的清除率的测定图1 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对?OH的清除

  2.2 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对超氧阴离子自由基的清除

  邻苯三酚在碱性溶液中自氧化的吸光度A 与时间t 的关系如图2 所示。室温下测定不同质量浓度的化合物对邻苯三酚自氧化体系的影响:先作出不同浓度下邻苯三酚自氧化的吸光度A 与时间t曲线,按式(Ⅱ)计算出该浓度下5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的O-2.的清除效率(S),再以浓度为横坐标,清除率S为纵坐标,做曲线如图3所示。图2 领苯三酚在碱性溶液中自氧化吸光度A与时间t的关系图3 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对超氧阴离子自由基的清除效率 (s)

  3 讨论

  由表1及图1可以看出,随着5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺浓度的逐渐增加,化学发光强度(I/I0)呈现逐渐降低的趋势,而抑制率((I0- I)/I0)则呈现逐渐增强的趋势,说明5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对?OH有清除作用,且呈现量效关系。其IC50(清除率为50%时溶液的浓度)为0.065 mg/mL,当浓度为0.25 mg/mL时,其清除率达92%。

  邻苯三酚在弱碱条件下(pH=8.2)能迅速氧化,不断反应生成超氧阴离子自由基(O-2.)和有色中间产物,该有色化合物在325 nm波长处有一特征吸收峰,吸光度值在反应开始一段时间之内随时间变化而线性增大。当有自由基清除剂存在时,可以清除O-2.,从而阻止中间产物的积累,使邻苯三酚自氧化产物在=325 nm处吸收峰值减小。在图2中直线吸光度A1的斜率K 即为邻苯三酚自氧化速率, 当反应体系中加入5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺(0.1 mg/mL) 后,体系的吸光度值A随时间t的变化如图2直线 吸光度A2所示, 直线斜率明显降低,即5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对O-2.有清除作用。图3 表明5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除O-2.的浓度依赖性。 由图3可知, 随着浓度的增加, 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺对O-2.的清除作用增强,该化合物浓度达到0.14 mg/mL 时,对O-2.的清除率达到50% ,相当于一个酶单位, 当该化合物浓度达到0.39 mg/mL时,对O-2.的清除率达到80% ,与茶多酚清除O-2.的能力相仿,表明5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺是一个较好的O-2.的清除剂。

  综上所述,通过鲁米诺化学发光法及邻苯三酚自氧化法对5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除羟自由基及超氧阴离子自由基能力的测定表明, 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺有着较好的抗氧化能力,同时5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺有着很好的水溶性,从而为该化合物的可能应用提供了一定的依据。

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